Câu 17 : Nguyên lý và các bước tiến hành giải trình tự gen bằng phương pháp sanger :

1. Nguyên lý :

Phương pháp Sanger dựa vào hoạt động của E DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, E.DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn của DNA đang tổng hợp ở vị trí 3_OH, khi gặp nucleotide không có nhóm 3_OH phản ứng tổng hợp dừng lại,

Đặc trưng của phương pháp là sử dụng các dideoxynucleotide ( ddNTP ) để làm ngưng các mạch đơn DNA đang được tổng hợp một cách ngẫu nhiên,

Chìa khóa của phản ứng là sử dụng các ddNTP không có nhóm 3_OH ở phân tử đường. Do đó E.DNA polymerase gắn chung vào sợi DNA thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Vì vậy phương pháp này còn được gọi là phương pháp dideoxy.

2. Các bước :

_ Đoạn DNA cần xác định trình tự cần phải được tạo dòng vào 1 vector tách dòng,

_ Thực hiện 4 phản ứng tổng hợp DNA trong 4 ống nghiệm khác nhau được tiến hành đồng thời,

_ Mỗi phản ứng là hỗn hợp gồm có sợi DNA cần giải trình tự gắn trong vector, DNA mồi mạch đơn khoảng 20 nucleotide bắt cặp với trình tự chuyên biệt trên vector, E.DNA polymerase, 1% ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ cho mỗi phản ứng và 4 loại dNTP,

_ Thực hiện phản ứng tổng hợp, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ có độ dài khác nhau do phân tử ddNTP sẽ gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng, và được nhận biết bằng phương pháp điện di,

_ Sản phẩm của 4 ống phản ứng cũng được phân ly trên cùng một bản gel thực hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các băng vạch DNA trên bản gel. Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel mà xác định trình tự các nucleotide trong gen theo chiều từ 5_3 từ dưới lên trên.